Реферат: Клонирование

Термин "клон" происходит от греческого слова "klon", что означает - веточка, побег, черенок, и имеет отношение, прежде всего к вегетативному размножению. Клонирование растений черенками, почками или клубнями в сельском хозяйстве, в частности в садоводстве, известно уже более 4-х тыс. лет. При вегетативном размножении и при клонировании гены не распределяются по потомкам, как в случае полового размножения, а сохраняются в полном составе в течение многих поколений.

Однако у животных есть препятствие. По мере роста их клеток, они в ходе клеточной специализации – дифференцировки – теряют способность реализовывать всю генетическую информацию, заложенную в ядре

Впрочем, оказывается, есть ящерицы-прыгуны, которые испокон веков размножаются именно клонированием, так как у них в роду есть только самки.

Хотя это не совсем клонирование, это называется партогенез. Эта встречающаяся в природе (прежде всего у беспозвоночных) форма однополого размножения предполагает развитие яйцеклеток без оплодотворения. Эксперименты по искусственному провоцированию партеногенеза начались еще в конце XIX века (работы русского зоолога Тихомирова). В дальнейшем ученые, применяя различные физико-химические раздражители, такие как растворы сильных кислот, трение, нагрев, сумели получить партеногенез у многих животных, в том числе млекопитающих

Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Опыты с ними показали, что серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность.

Уже в начале 90-х была решена и проблема клонирования эмбриональных клеток млекопитающих. Реконструированные яйцеклетки крупных домашних животных, коров или овец сначала культивируют не in vitro, a in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша.

Статья Уилмута с соавторами, появившаяся в начале 1997 года, стала сенсационной именно потому, что впервые клональное животное (овца по кличке Долли) появилось в результате использования донорского ядра клетки молочной железы взрослой овцы. У этого первого успешного эксперимента есть существенный недостаток - очень низкий коэффициент выхода живых особей (0,36%). Однако он доказывает возможность полноценного клонирования, (или получения копии взрослого человека). Остаётся лишь разрешить технические и этические вопросы.

Самое интересное, что методология клонирования, использованная Уилмутом, была подготовлена в СССР ещё в 1987-ом году, но в Академии наук на это прореагировали вяло - не до того, видимо…

Первые опыты на амфибиях

Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Американские исследователи Бриггс и Кинг разработали микрохирургический метод пересадки ядер эмбриональных клеток с помощью тонкой стеклянной пипетки в лишенные ядра (энуклеированные) яйцеклетки. Они установили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии его развития - бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и превращается в нормального головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию - гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. Эти результаты позже были подтверждены и в других работах.

Большой вклад в эту область внес английский биолог Гердон. Он первым в опытах с южноафриканскими жабами Xenopus laevis (1962) в качестве донора ядер использовал не зародышевые клетки, а уже вполне специализировавшиеся клетки эпителия кишечника плавающего головастика. Ядра яйцеклеток реципиентов он не удалял хирургическим путем, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В большинстве случаев реконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно десятая часть их них образовывала эмбрионы. 6,5% из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5% - стадии головастика и только 1% развился в половозрелых особей (рис. 1). Однако появление нескольких взрослых особей в таких условиях могло быть связано с тем, что среди клеток эпителия кишечника развивающегося головастика довольно длительное время присутствуют первичные половые клетки, ядра которых могли быть использованы для пересадки. В последующих работах как сам автор, так и многие другие исследователи не смогли подтвердить данные этих первых опытов.

Позже Гердон модифицировал эксперимент. Поскольку большинство реконструированных яйцеклеток (с ядром клетки кишечного эпителия) погибают до завершения стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии бластулы и снова пересадить их в новые энуклеированные яйцеклетки (такая процедура называется "серийной пересадкой", в отличие от "первичной пересадки"). Число зародышей с нормальным развитием после этого увеличивалось, и они развивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, полученными в результате первичной пересадки ядер.

Затем Гердон вместе с Ласки (1970) стали культивировать in vitro (вне организма в питательной среде) клетки почки, легкого и кожи взрослых животных и использовать уже эти клетки в качестве доноров ядер. Примерно 25% первично реконструированных яйцеклеток развивались до стадии бластулы. При серийных пересадках они развивались до стадии плавающего головастика. Таким образом, было показано, что клетки трех разных тканей взрослого позвоночного (X. laevis) содержат ядра, которые могут обеспечить развитие, по крайней мере, до стадии головастика.

В свою очередь ДиБерардино и Хофнер использовали для трансплантации ядра неделящихся и полностью дифференцированных клеток крови - эритроцитов лягушки Rana pipiens. После серийной пересадки таких ядер 10% реконструированных яйцеклеток достигали стадии плавающего головастика. Однако даже с помощью многократных серийных пересадок (более 100 клеточных циклов) реконструированные яйцеклетки дальше стадии головастика не развивались.

Таким образом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер могут быть лишь зародыши на ранних стадиях развития. Некоторые авторы называют подобные эксперименты клонированием амфибий, хотя правильнее называть их клонированием эмбрионов амфибий, так как в этом случае мы размножаем бесполым путем не взрослых животных, а зародышей.

Дифференцировка клеток в ходе развития позвоночных сопровождается инактивацией неработающих генов. Поэтому клетки теряют тотипотентность, дифференцировка становится необратимой. В конце концов у одних клеток происходит полное репрессирование генома, у других - в той или иной степени деградирует ДНК, а в некоторых случаях разрушается даже ядро. Однако наряду с дифференцированными кочетками культивируемые in vitro клеточные популяции содержат малодифференцированные стволовые клетки, которые и могут быть использованы как доноры ядер для клонирования млекопитающих.

Опыты с амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и того же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность.

Неудачи экспериментов с мышами

Успешные опыты с амфибиями заставили ученых задуматься о клонировании эмбрионов млекопитающих, в частности мышей. МакКиннел в одной из своих работ отмечал, что все необходимые для этого методы уже существуют, и непонятно, почему мышь до сих пор не клонирована. По его мнению, первыми объектами должны были стать именно мелкие животные, такие как мышь или кролик. Однако предсказание

МакКиннелла не сбылось, хотя в конце 70-х годов опыты на мышах действительно начались и протекали весьма драматично. К тому времени, замечу, весьма основательно были изучены биология и генетика ранних этапов развития млекопитающих, и, в частности, мыши как модельного объекта.

Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амфибий. Однако эти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы научились микрохирургически удалять пронуклеусы из зигот (оплодотворенных яйцеклеток) мыши и пересаживать в них клеточные ядра ранних эмбрионов. Однако все полученные разными способами зародыши мышей развивались лишь до стадии бластоцисты.

В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том, что они получили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели только материнский, а две - отцовский геном. Это, якобы, зависело от того, какой пронуклеус был оставлен в яйце - женский или мужской, он и определял развитие особи по типу гиногенеза или андрогенеза. Их успех был связан, но описанию авторов, с тем, что, удаляя один пронуклеус, они удваивали число хромосом другого, обрабатывая яйца специальным веществом, затем выращивали полученные диплоидные гомозиготные (с двумя одинаковыми наборами генов) зародыши in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития.

Казалось, теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной гомозиготностью по всем генам. Это особенно важно в селекции, так как для получения сельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого скота, с закрепленными особо ценными качествами обычными приемами требуются десятки лет работы.

Однако, к сожалению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя многие пытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся из неоплодотворенной яйцеклетки) эмбрионы.

Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в клетку, МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер использовали зиготы, но если донорами были ранние эмбрионы, то реконструированные яйцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии бластоцисты.

Метод МакГрата и Солтера стал широко использоваться разными экспериментаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц, активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы мышей. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в партеногенетически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши развивались нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если добавить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом яйцеклетки, то нормального развития не происходит, добавление же мужского ядра приводит к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинации мужского и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мышей обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужских или двух женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона.

Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающих требуются два набора хромосом - отцовский и материнский. Поэтому ни у одного из известных видов млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому работы Хоппе и Илменси не удалось повторить.

Однако эти исследователи еще дважды будоражили научное сообщество. В 1982 году они пересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в энуклеированные зиготы. Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток нормально развивались, и якобы были получены четыре взрослых самки. В свете вышесказанного эти результаты весьма маловероятны.

Гибель партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических зародышей у млекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе материнского и отцовского геномов. Механизм, регулирующий эти функциональные различия, был назван геномным импринтингом и изучался в ряде работ, где было показано, что для нормального развития млекопитающих требуется наличие мужского генома. Другая статья Илменси и Хоппе имела еще больший резонанс.

Авторы сообщили о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей (двух самок и самца), генетически идентичных донорской линии мышей. Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один прием, затем реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три развились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторы использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще более поздних стадий (7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. Однако никто из работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение.

МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает возможность развиваться только до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных зародышей, смогли достичь стадии морулы или бластоцисты.

Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные ядра рано теряют тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно расширили наши представления о методологии клонирования млекопитающих.

Кролики, коровы и свиньи

Американские исследователи Стик и Робл, используя методику МакГрата и Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.

Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании.

Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и Солтером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали, чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в энуклеированную зиготу.

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные зародыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коровы, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности, сообщил, что ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточного зародыша (рис. 3). Автор утверждал, что большинство ядер сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. После пересадки в матку коров - окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и дальше нормально развиваться.

Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.

Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены. Но остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью, для клонирования взрослых животных.

Клонированию эмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа. Скудность данных, видимо, и связана с определенными трудностями работы с этим объектом.

Клонирование овец

Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной стадии развития ядра сохраняют тотипотентность. Реконструированные яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались нормально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго реципиента - еще 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клеточных зародышей и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров.

В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона и ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец. В первом случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью сформировавшийся ягненок погиб во время родов. Его фенотип также соответствовал породе - донору. Авторы считали, что в ходе дифференцировки эмбриональных клеток происходит инактивация некоторых важных для развития генов, в результате которой ядра бластоцисты уже не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые in vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают тотипотентностью.

Позднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки (фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м пассажах и клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе. (Поэтому, видимо, нет строки необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro. Однако для полной уверенности в этом нужны дополнительные данные.)

Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода - для двух и эмбриональные клетки - четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента (рис. 4). Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат.

Успех авторов этой работы, прежде всего, связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Но вернёмся к клонированию человека. Существует несколько способов обойти этические проблемы – выращивать отдельные органы из клеток реципиента или использовать животных. Но это только "косметический" метод. Реальный шаг к бессмертию - искусственное изменение ДНК. В июне 2000 года и случилось то, чего так долго ждали и чего некоторые так боялись. Появилось сообщение, что ученым из уже знаменитой своей овцой Долли шотландской фирмы PPL Therapeutics (коммерческого отделения Розлин Института в Эдинбурге) удалось получить успешные клоны овечек с измененной ДНК. Шотландские ученые смогли осуществить клонирование, при котором генетический материал клона был "подправлен" с лучшую сторону. Однако именно этого, генетического вмешательства и боятся многие противники клонирования.

Хотя существует и уже узаконенный путь обхода запрета на клонирование человека, который называется "терапевтическое" клонирование человеческих существ. Речь идет о создании ранних эмбрионов - своего рода банка донорских тканей для конкретных индивидуумов. Именно используя его, американская компания Advanced Cell Technology Inc. (ACT, город Вустер, штат Массачусетс) объявила в ноябре 2001 года об успешном клонировании человеческого эмбриона.

Интересно отметить, что эта компания в октябре получила правительственный грант 1.8 млн. $ на проведение исследований в области биотехнологии. Порадовала и реакция конкурентов: "Я очень рада, что мы не одиноки. Мы получаем эмбрионы каждый день", - заявила директор Clonaid Бриджит Боселье (Brigitte Boisselier).

Для эксперимента учёные использовали в общей сложности 17 женских яйцеклеток: удалив из них ядра, они внедрили на их место ядра, позаимствованные из клеток кожи взрослого человека. В трёх яйцеклетках начался нормальный процесс роста и деления. Когда эмбрионы состояли из 6-ти клеток каждый, учёные прервали их дальнейшее развитие с тем, чтобы использовать полученные клетки для дальнейших исследований.

Следует отметить, что стволовые клетки, которые, собственно, и являются предметом интереса ученых, занимающихся исследованиями в области терапевтического клонирования, можно выделить только из эмбриона, в своем развитии достигшего стадии бластоцисты (около сотни клеток). Однако специалисты ACT заявляют, что созданные ими, в другом эксперименте, обезьяньи зародыши развились до стадии бластоцисты. Из эмбрионов были выделены стволовые клетки, которые в ходе их специализации удалось превратить в нейроны. Сообщается, что эти нейроны оказались в состоянии вырабатывать допамин и серотонин - два важнейших гормона, которые вырабатываются мозгом.

В интервью CNN президент компании ACT доктор Майкл Вест сказал, что его компания не заинтересована в клонировании людей, и что она не создавала эмбрион человека для репродуктивных целей "Мы только хотим помочь больным людям, нуждающимся в помощи, и в этом состоит работа всего нашего центра".

Определение лечебного клонирования человека

Одобрение и разрешение терапевтического клонирования человека основывалось на морально-этическом различии между "репродуктивным" и "терапевтическим" клонированием. Репродуктивное клонирование - это воспроизведение всего человеческого организма целиком. Лечебное же (медицинское, терапевтическое) клонирование по определению прекращает копирование человеческих клонов на эмбриональной стадии и не допускает имплантации и нормальной беременности. При терапевтическом клонировании эмбрион разрушают на ранней стадии развития - на стадии бластоцита, и получают из него культуру стволовых клеток. Для получения этой клеточной массы, которая при нормальной беременности дает начало плоду, эмбрион неизбежно следует разрушить. Стволовые клетки человеческого эмбриона называют плюрипотентными стволовыми клетками (ПСК), поскольку они могут давать начало разнообразным типам клеток. В ноябре 1998 года доктор Томсон (Thomson) в Висконсинском университете получил культуру стволовых клеток человеческого эмбриона из зародышей, предоставленных клиниками по искусственному оплодотворению в пробирке - in vitro. Эти клетки были плюрипотентны, то есть обладали большими возможностями, и неограниченно делились в лабораторных условиях. При имплантации под кожу мыши они давали начало клеткам выстилки кишечника, хряща, кости, мышц и эпителия нервной системы.

Открытие способности стволовых клеток эмбриона давать начало другим типам клеток породило веру в их целебные свойства, с помощью которых можно победить едва ли не любую болезнь и избежать старения. Было высказано мнение, что наивысший терапевтический потенциал эмбриональных стволовых клеток в обновлении тканей может быть реализован при их выделении из собственных клеток пациента. Чтобы получить "по заказу" такие индивидуально специфичные ПСК, требуется применить метод переноса ядра соматической клетки (ПЯСК) - этот же метод был использован при клонировании овцы Долли для создания эмбриона, идеально подходящего пациенту. Цель эмбрионального, или терапевтического, клонирования состоит в получении стволовых клеток человеческого эмбриона, идентичных собственным клеткам пациента, что со временем можно будет использовать для лечения болезней. Пока же о стволовых клетках эмбриона известно лишь то, что из них можно получать клетки разных типов, которые способны длительное время существовать в лабораторной культуре. Способности же управлять дифференцировкой и пролиферацией пока остаются на уровне гипотез.
Эмбрион – нечто большее, чем человеческая ткань?
Две крайние точки зрения на ограниченное клонирование отражают две морально-этические позиции по отношению к эмбриону человека. Эмбриолог Уинстон (Winston) утверждает: "Никто не собирается, да и не может клонировать человеческие эмбрионы... Всё, что нам нужно, - получить ткань эмбрионального происхождения и выделить из нее участки клеток, с помощью которых можно будет лечить больных людей". Однако профессор Скэрисбрик (Jack Scarisbrick) говорит иное: "Это - клонирование. Вы создаете точную копию человека. И от этого нового человека отрываете кусок, а потом убиваете его". Почему двое высокообразованных ученых высказывают прямо противоположные мнения об одной и той же методике? Первое мнение отражает биологический подход. Согласно ему, эмбрион, который не прошел имплантацию и внутриутробное развитие, не имеет никаких интересов, которые общество должно защищать. Такой эмбрион - не более чем скопище клеток, управляемых не мозгом, а генетическим кодом. Противоположный подход рассматривает эмбрион как живого человека, которого следует воспринимать как полноценную личность с первого мгновения его существования. "Вопрос не в том, похож ли развивающийся человеческий зародыш на взрослого человека, а в том, соответствует ли его развитие человеческой природе на данной конкретной стадии" (5). Общество обязано защищать человеческий эмбрион в силу его генетической уникальности и способности вырасти в личность. Вот почему эксперименты над эмбрионами - ничем не оправданное убийство.

В 1994 году Национальный институт здоровья США учредил комиссию по вопросу о человеческом эмбрионе с целью примирения этих двух противоположных точек зрения. Был разработан компромиссный подход, согласно которому эмбрион - не личность, но, будучи формой человеческой жизни, обладает моральной ценностью. Критерий этого промежуточного статуса - определение человеческой жизни и личности через обладание тремя обусловленными деятельностью мозга способностями: сознанием, способностью мыслить и способностью ощущать. Был сделан вывод, что человеческая личность проявляется только на 14-й день развития. В основу этого вывода легли три биологических факта. Во-первых, первичная полоска - предшественник центральной нервной системы развивается на 14-й день (6). Во-вторых, на ранних стадиях развития эмбриона его индивидуальность размыта. До седьмого-десятого дня развития возможны два явления: формирование близнецов и мозаицизм. Формирование близнецов - способность эмбриона разделяться и образовывать несколько генетически идентичных особей. В случае мозаицизма два разных зародыша сливаются воедино, образуя один организм с двумя различными геномами. И, наконец, приблизительно на 14-й день (иногда раньше, на 7-й -10-й день) происходит имплантация в стенку матки; до 60% эмбрионов при естественном оплодотворении не имплантируются в теле матери. Вывод: если в природе большинство зародышей в возрасте менее 14 дней погибают естественным путём, то эксперименты над эмбрионами допустимы до достижения 14 дней без имплантации.

Устойчивость компромиссной точки зрения.

Многих убеждает утверждение, что жизнь человека обретает уникальную, только ей присущую ценность лишь тогда, когда человек становится личностью. Есть ещё одна сходная точка зрения, рассматривающая человеческий эмбрион с позиций роста и развития: моральная ценность внутриутробной жизни возрастает с течением беременности, и на поздних её стадиях (или к моменту рождения) достигает общечеловеческого уровня. Однако принципиально важно рассмотреть предпосылки, на которых основаны "моральная граница" 14-го дня беременности и запрет на имплантацию эмбриона. Первая предпосылка: личностность должна определяться нашим восприятием человека как такового. Вторая предпосылка: составляющие личности - сознание, способность мыслить и способность ощущать. Третья предпосылка: первичная полоска есть точная мера сознания, способности мыслить и способности ощущать.

Очевидно, что, в соответствии с биологическими данными, сознание, способность мыслить и способность ощущать развиваются на более поздних стадиях. В недавней статье в "Журнале Американской медицинской ассоциации" (JAMA) Ланца (Lanza) и др. доказывают, что это - чёткая и реальная граница, поскольку как только формируется первичная ось тела, обретает конкретность "индивидуальность", являющаяся ключевым понятием для определения личности. Другие же учёные признают, что граница 14-го дня выбрана произвольно, поскольку "биологически" ясно, что раньше этого времени жизнь существовать не может. Специалист по этике из Принстонского университета Питер Сингер (Peter Singer) предполагает, что "новорожденный ребёнок не способен ни к самосознанию, ни к осознанию собственного существования во времени - он приобретает эти качества много позже. Это - не личность. Его жизнь заслуживает защиты не более, чем жизнь плода". "В нашей книге "Должен ли ребенок жить?" моя коллега Хельга Кузе (Helga Kuhse) и я высказываем предположение: только в возрасте 28 дней о новорожденном можно сказать, что он имеет такое же право на жизнь, как любой человек. И, конечно же, лишь намного позже ребенок приобретает чувство собственного существования во времени…". Если довести ход мысли сторонников "личностного подхода" до логического завершения, выходит, что инвалиды, умственно отсталые люди, маленькие дети и старики - неполноценные члены общества.

"Имплантационный подход", на первый взгляд, кажется обоснованным. В определенных ситуациях прерывание беременности - в интересах общества; ведь страшно подумать, что можно дать жизнь эмбрионам, возникшим в ходе экспериментов, мутантным и клонированным. Нельзя допустить, чтобы такие дети появлялись на свет. Вообще, клонирование человека недопустимо, потому что оно нарушает принцип уникальности каждой человеческой личности. Клонирование обесценивает уникальность личности - весьма вероятно, что клонированный человек будет считаться неполноправным по отношению к человеку, появившемуся на свет обычным образом. В отношении исследований плодов в матке уже разработаны этические нормы, допускающие вмешательство в тех случаях, когда ожидаемая польза перевешивает риск жизни личности плода. Следовательно, согласно этому подходу, эксперименты над эмбрионами или клонирование допустимо производить только в лабораторных условиях, и результатом этих операций может быть лишь производство клеточной массы, а не тканей и органов.

Но чем отличаются эмбрион в утробе и эмбрион в чашке Петри? Есть мнение, что "разница между эмбрионом в утробе и гаметами в чашке Петри состоит в том, что эмбриону для развития достаточно "естественного" существования… Лабораторный же эксперимент требует активного, направленного и "искусственного" (в виде механического переноса в матку) вмешательства третьей стороны, без которого беременность невозможна". Иначе говоря, перенесение эмбрионов, зачатых или клонированных в чашке Петри, в утробу - искусственный процесс. Это - любопытное замечание, учитывая, что гаметы требуют такого же "активного, направленного и "искусственного" (в виде механического переноса) вмешательства" в первую очередь для того, чтобы попасть в чашку Петри. Если мы против искусственного переноса гамет из чашки Петри, то почему мы должны радоваться их искусственному переносу в чашку Петри? На это отвечают: "Чтобы бесплодные пары могли иметь детей".

Создание эмбрионов для научных исследований

Создание эмбрионов было позволено для размножения рода человеческого. Но совсем другое дело - создавать эмбрионов, чтобы ставить на них эксперименты. Во-первых, разрешение на создание экспериментальных эмбрионов поднимает проблему инструментализации - создания человеческой жизни исключительно в утилитарных целях. Во-вторых, клонированные эмбрионы или полученные из них стволовые клетки имеют большую коммерческую ценность, а значит, встает проблема коммодификации людей - возможности торговли человеческой жизнью. Создание эмбрионов в целях эксперимента подрывает принцип самостоятельной ценности человеческой жизни. Жизнь ценна сама по себе, а не потому, что из нее можно извлечь пользу при лечении болезни. США выступили против создания эмбрионов в научных целях, но предложили разрешить производство стволовых клеток из эмбрионов, не усыновленных после искусственного оплодотворения, поскольку "лишние" эмбрионы и выброшенные плоды обречены на неминуемую гибель, и мы не должны отказываться от их использования для пополнения медико-биологического знания и возможности оказать медицинскую помощь больным. Но разве эмбрион, произведенный путем клонирования, имеет меньшую ценность, чем эмбрион, порожденный слиянием яйцеклетки и сперматозоида?

Цель оправдывает средства?

Для оправдания терапевтического клонирования привлекаются богословские и утилитарные аргументы. Высказывается мысль, что общество должно быть застраховано от наиболее очевидной опасности: от имплантации клонированного эмбриона и, следовательно, появления детей-клонов. Однако следует разрешить применение методов, способствующих излечению диабета, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рака, сердечных заболеваний, артрита, ожогов и болезней спинного мозга. Этика же не может оправдать терапевтическое клонирование человека. Во-первых, нельзя создавать эмбриона просто для того, чтобы другие люди его использовали. Более того, если такие эксперименты окажутся успешными, то спрос на эмбрионы для удовлетворения человеческих нужд будет расти. К тому же, необходимо будет создавать экспериментальные эмбрионы, чтобы определить, будет ли от них медицинская польза.

Обратимся к принципам исследований человека, на концепцию этики исследований человеческого организма оказали влияние три плодотворных документа, касающихся этических норм. Это Нюрнбергский кодекс (1946-49 гг.), Бельмонтский доклад (1979 г.) и Хельсинкская декларация (1964 г., поправки внесены в 2000 г.). Хотя каждый из этих документов посвящён отдельным вопросам, из всех них вытекают общие руководящие принципы. Научные эксперименты, равно как и исследования, должны быть высочайшего качества. Предварительные эксперименты над животными должны давать плодотворные и многообещающие результаты. Если для достижения цели применим метод, не требующий экспериментов над людьми, то такие эксперименты проводиться не должны.

Пока что все клонированные животные или рождаются с генетическими аномалиями, или оказывают не в состоянии произвести на свет здоровое потомство.

Специалисты-биологи спорят о возможных причинах этого на страницах журнала Science.

Сотрудники двух известных американских научных центров использовали мышей для того, чтобы понять, что же именно нарушается в работе организма при клонировании. Выяснилось, что у клонированных мышей ДНК изменена и не вполне соответствует нормальной. Некоторые из генов, как говорят ученые, "не включаются".

"Стало быть, можно предположить: даже клоны, которые кажутся здоровыми, рождаются с нарушениями генетического кода", - говорит один из авторов исследования, профессор Рудольф Йенич.

"Экспериментировать на людях пока рано", - считает он.

Создатель Долли согласен

Такой же точки зрения придерживается и британский ученый Ян Вилмут - один из создателей известной во всем мире овечки Долли. В интервью Би-би-си он заявил: "Клонирование людей приведет к тому, что младенцы будут рождаться с серьезными отклонениями от нормы".

Очередным доказательством справедливости собственных слов профессор Вилмут и считает результаты работ американских ученых.

"Пока что результаты клонирования мы можем предсказывать только приблизительно, - говорит профессор Вилмут. - И неважно, идет ли речь о мышах, овцах, коровах или, если уж на то пошло, о людях".

Кстати, в 2002 году у знаменитой Долли было отмечено развитие артрита, который, как предполагается, мог стать результатом генных мутаций, инициированных процессом клонирования. Помимо артрита у животного наблюдался целый ряд отклонений от нормального развития, и в феврале учёные усыпили овечку из-за рака лёгких. Но опухоль могла быть и не вызвана процессом клонирования, за два года до кончины Долли умерла от той же болезни её соседка по камере.

«Мы понимали, что животное в опасности, - говорит создатель Долли Йен Уилмут из Института Рослин в Эдинбурге. - Тем более что инфекции гораздо быстрее распространяются, когда овец содержат в закрытых помещениях». Но спасать ценного клона почему-то не стали - в карантин не отправили.

Но возможно ли клонирование человека?

Учёные из США считают, что клонирование человека может оказаться неосуществимым по биологическим причинам. Они заявляют, что сотни попыток создать клон обезьяны провалились. По их словам, устройство яйцеклеток приматов, в том числе и человека, делает их клонирование практически невозможным. "Таким образом, подтверждается тот факт, что шарлатаны, сообщавшие о клонировании человека, никогда не понимали клеточной биологии настолько хорошо, чтобы добиться успеха", - заявил руководитель группы доктор Джеральд Шаттен.

Клонированию успешно подвергаются некоторые животные, в том числе мыши, овцы и другой скот, однако в последнее время появляются все более явные признаки того, что не все виды можно воспроизвести искусственным путем. Исследование, результаты которого были опубликованы в журнале Science, усиливает сомнения в том, что заявления компании Clonaid о создании первых человеческих клонов являются правдой. Эта компания, созданная последователями уфологического культа раэлитов, сообщила о рождении уже нескольких детей-клонов, однако до сих пор не предоставила убедительных доказательств

Большинство ученых сходятся на том, что попытки создать клон человека опасны и сомнительны с моральной точки зрения. Многие клоны животных появлялись на свет с теми или иными отклонениями. Здоровыми они рождались редко, сообщает BBC.

Исследователи университета Питтсбургской школы медицины попытались клонировать макаку-резус с помощью технологии, использовавшейся при создании клона знаменитой овцы Долли. После сотен попыток им так ни разу не удалось добиться беременности у носителя клона. Другим группам ученым также не удалось клонировать обезьян. Судя по всему, у приматов при делении клонированных клеток ДНК не передается новым клеткам должным образом. Некоторые клетки в итоге получают либо слишком много, либо слишком мало ДНК, и оказываются нежизнеспособными. Ученые полагают, что попытки клонировать других приматов, в том числе и человека, скорее всего, обречены на провал.

Тем временем японские ученые утверждают, что нашли альтернативу технике клонирования при выращивании отдельных органов. Исследователи из Института репродукции человека при Киотском университете объявили, что им впервые в мире удалось вернуть обычные клетки крови к тому состоянию, когда из них можно получить абсолютно любой трансплантант.

В ходе опытов у лабораторных мышей изъяли лимфоциты и при помощи электрошока объединили их с зародышевыми стволовыми клетками - предшественницами всех взрослых тканей, составляющими "тело" эмбриона. Полученный гибрид пересадили в питательную среду и по прошествии короткого времени лимфоциты превратились в клубок клеток самой разной "ориентации". В нем были намешаны начальные формы костной, мышечной, нервной и прочих тканей. Оставалось только вычленить необходимую клетку и создать условия для ее дальнейшего перерастания в отдельный орган.

Как говорят ученые, новая техника репродукции обещает прорыв в трансплантологии - донором в данном случае выступает сам же реципиент. Это также, по их мнению, позволяет обойти этические проблемы, которые возникают при клонировании, когда роль "фабрики запчастей для тела" играют зародыши-клоны.

Заключение

Итак, работы по клонированию позвоночных были начаты на амфибиях в начале 50-х годов и интенсивно продолжаются вот уже более четырех десятилетий. Что касается амфибий, то, как было сказано в соответствующем разделе, несмотря на значительные достижения, проблема клонирования взрослых особей остается до сих пор не решенной. Установлено, что в ходе клеточной дифференцировки у позвоночных происходит или потеря определенных генных локусов или их необратимая инактивация. Судя по всему, утрачивается та часть генома, которая контролирует не ранние, а более поздние этапы онтогенеза. Механизм этого явления пока не поддается научному объяснению. Но очевидно, что для клонирования взрослых позвоночных необходимо использовать малодифференцированные делящиеся клетки.

Что касается этической стороны дела, то заповеди, которыми человечество пользуется века, к сожалению, не предусматривают новых закономерностей и возможностей, какие вносит в нашу жизнь наука. Поэтому людям и необходимо обсуждать и принимать новые законы общежития, учитывающие новые реальности.